C/EBPα Mediated Transcriptional Regulation of Human ADAMTS-3 Gene and Collagen Expression in Osteosarcoma Cells

Abstract

ADAM Metallopeptidase with Thrombospondin Type 1, Motif 3 (ADAMTS-3) is a procollagen amino proteinase mainly expressed in type II collagen-rich tissues and its primary function is to maturate amino ends of the type II collagen precursors. This maturation process allows correct fibril formation. ADAMTS-3 also has a tumor-suppressive function by regulating the fibronectin expression in the extracellular matrix (ECM.) CCAAT/enhancer-binding protein (C/EBPα) is a transcription factor playing a pivotal role in the cell cycle regulation. Dysregulations in the C/EBPα expression have been reported in solid tumors. C/EBPα expression has been identified to be associated with the metabolism and prognosis of a malignant bone tumor, osteosarcoma (OS). High heterogeneity, metastasis capability, and recurrence lead to poor prognosis and survival rates in OS. Multiple genetic and epigenetic factors affect OS development. Alterations in the ECM elements are closely related to OS development and progression. According to the in-silico analyses, the ADAMTS-3 promoter includes multiple C/EBPα binding sites suggesting that C/EBPα could have a regulatory effect on ADAMTS-3 transcriptional regulation. In the present study, over-expression of the C/EBPα decreased ADAMTS-3 mRNA and protein levels in Saos-2 and MG-63 osteosarcoma models. Ectopic expression of the C/EBPα also led to alterations in some fibrillar collagen expression levels. Enhanced C/EBPα levels resulted in an increase in the type I and II collagen expression levels but didn’t change the type III collagen expression level in Saos-2 cells. On the contrary, increased C/EBPα levels resulted in a decrease in all collagen expression levels in MG-63 cells Co-transfection analysis revealed that C/EBPα negatively regulates ADAMTS-3 promoter activity in both Saos-2 and MG-63 cells. Further EMSA studies indicated that C/EBPα functionally binds to the proximal region of the ADAMTS-3 gene. Our findings will contribute to understanding C/EBPα mediated regulation of ADAMTS-3 and collagen composition in osteosarcoma cells.

ADAMTS-3, temelde tip II kollajen bakımından zengin dokularda eksprese edilen ve primer görevi tip II kollajen öncüllerinin amino uçlarını olgunlaştırmak olan bir prokollajen amino proteinazdır. Bu olgunlaşma süreci fibril oluşumunun düzgün olmasını sağlar. ADAMTS-3, hücrelerarası matriksteki (ECM) fibronektin ekspresyonunu düzenleme yoluyla tümör baskılayıcı bir işleve de sahiptir. C/EBPα, hücre döngüsü düzenlemesinde oldukça önemli rol oynayan bir transkripsiyon faktörüdür. Solid tümörlerde, C/EBPα ekspresyonunda düzensizlikler bildirilmiştir. C/EBPα ekspresyonunun, malign bir kemik tümörü olan osteosarkomanın (OS) metabolizması ve prognozu ile ilişkili olduğu tespit edilmiştir. Yüksek heterojenite, metastaz yeteneği ve rekürrens, OS'de kötü prognoz ve düşük sağkalım oranlarına yol açmaktadır. Osteosarkoma oluşumunda birçok genetik ve epigenetik faktör etkilidir. ECM bileşenlerindeki değişiklikler, OS oluşumu ve progresyonuyla yakından ilişkilidir. In-silico analizlere göre, ADAMTS-3 promotoru birçok C/EBPα bağlanma bölgesi içermektedir. Bu durum, C/EBPα’nın ADAMTS-3 geninin transkripsiyonel regülasyonu üzerinde etkili olabileceğini düşündürmektedir Bu çalışmada, C/EBPα'nın over-ekspresyonu, Saos-2 ve MG-63 osteosarkoma modellerinin her ikisinde de ADAMTS-3 mRNA ve protein seviyelerini azaltmıştır. C/EBPα'nın ektopik ekspresyonu ayrıca bazı fibriller kollajenlerin ekspresyon seviyelerinde de değişikliklere yol açmıştır. Saos-2 hücrelerinde, artan C/EBPα seviyesi, tip I ve II kollajenlerin ekspresyon seviyelerinde artışla sonuçlanmış ancak tip III kolajen ekspresyon seviyesini değiştirmemiştir.MG-63 hücrelerinde ise tersi şekilde, artan C/EBPα seviyesi tüm kollajen ekspresyon seviyeleri için bir düşüşle sonuçlanmıştır. Ko-transfeksiyon analizi, C/EBPα'nın hem Saos-2 hem de MG-63 hücrelerinde ADAMTS-3 promotör aktivitesini negatif olarak düzenlediğini ortaya koymuştur. EMSA çalışmaları, C/EBPα'nın ADAMTS-3 geninin proksimal bölgesine işlevsel olarak bağlandığını göstermiştir. Bulgularımız, osteosarkoma hücrelerinde ADAMTS-3’ün ve kollajen kompozisyonunun C/EBPα aracılı regülasyonunun anlaşılmasına katkıda bulunacaktır.