Solunum yolu örneklerinden izole edilen tüberküloz dışı mikobakterilerin PCR-RFLP yöntemi ile tanımlanması

Abstract

Amaç: Mikobakterilerin tür düzeyinde hızlı ve doğru tanımlanması hastalığın etkene özgün tedavisi için önemlidir. Tanımlamada kullanılan konvansiyonel yöntemler uzun zaman alması, tartışmalı sonuçları ve mevcut olan 170 üzerindeki türü tanımlamadaki sınırlılıklarıyla günümüzde yerini moleküler yöntemlere bırakmıştır. Bu çalışmada Adıyaman Üniversitesi Eğitim ve Araştırma Hastanesi ile Atatürk Göğüs Hastalıkları ve Göğüs Cerrahisi Eğitim Araştırma Hastanesi'nden (Dr. İsmail Ceyhan) gönüllülük esasına dayalı olarak gönderilen solunum yolu örneklerinden soyutlanan 34 adet tüberküloz dışı mikobakteri (TDM) izolatının ve 14 adet referans suşun PCR-RFLP yöntemi ile tür düzeyinde tanımlanması amaçlanmıştır. Yöntem: Çalışmamızda Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Lenght Polymorphism (PCR-RFLP) yöntemi kullanılmıştır. Laboratuvarımıza gelen izolatların Löwenstein-Jensen besi yerlerine ekimi yapılarak üremeleri sağlanmıştır. Üreyen kültürlerden alınan örneklerin kaynatma yöntemiyle DNA izolasyonu yapıldıktan sonra hsp65 gen bölgesine özgün primerler kullanılarak, PCR ile amplifiye edilmiştir. Amplifikasyon sonrası PCR ürünleri BstEII ve HaEIII enzimleri ile bir gece bekletildikten sonra DNA fragmanları referans algoritmalar ile karşılaştırılarak değerlendirilmiştir. Bulgular: Çalışmamızda kullanılan 34 izolattan TDM'lerin tür dağılımı; %23,52(8/34) M. intracellulare, %17,64 (6/34) M. gordonae, %17,64 (6/34) M. abscessus, %17,64 (6/34) M. simiae, %5,88 (2/34) M. lentiflavum, %2,94 (1/34) M. kansasii, %2,94 (1/34) M. scrofulaceum olarak belirlendi. Örneklerden 4 tanesi değerlendirilemedi. Sonuç: Çalışmamızda kullanılan mikobakteri izolatlarından en yaygın olarak saptanan türlerin M. intracellulare, M. abscessus ve M. simiae olduğu tespit edilmiştir. Bu çalışmaya göre PCR-RFLP yöntemi mikobakterilerin tür düzeyinde tanımlanmasında konvansiyonel yöntemlere göre daha hızlı ve kesin tanı sağlayan faydalı bir yöntemdir. Ancak enzimle kesim işlemleri sonrasında oluşan DNA fragmanlarının değerlendirilmesi ve referans algoritmalar ile karşılaştırılması aşamalarının kritik önem taşıdığı görüldü. Özellikle görüntüleme işlemlerindeki standardizasyonun doğru türü belirlemede oldukça önemli olduğu sonucuna varıldı.

Background: Rapid and accurate identification of mycobacteria is important for the treatment of the disease. Conventional methods used in identification have long been replaced by molecular methods with their controversial results and limitations in identifying over 170 species. In this study, it was aimed to identify 34 NTM isolates and 14 reference strains isolated from respiratory tract samples (sputum) sent from Adıyaman University Training and Research Hospital and from Atatürk Thoracic Diseases and Thoracic Surgery Training and Research Hospital (Doc. İsmail Ceyhan) according to the voluntary procedure at specify level by PCR-RFLP method. Material and methods: In our study, Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Lenght Polymorphism (PCR-RFLP) method was used. It was ensured that the isolates coming to our laboratory were cultivated on LJ media. DNA isolation was performed by boiling the samples from the cultivated cultures and then amplified by PCR using primers specific to the hsp65 gene region. After amplification, PCR products were kept overnight with BstEII and HaEIII enzymes, and DNA fragments were evaluated by comparison with reference algorithms. Results: Species distribution of NTMs out of 34 isolates used in our study; 23.52% (8/34) M. intracellulare, 17.64% (6/34) M. gordonae, 17.64% (6/34) M. abscessus, 17.64% (6/34) M. simiae was determined as 5.88% (2/34) M. lentiflavum, 2.94% (1/34) M. kansasii and 2.94% (1/34) M. scrofulaceum. 4 of the samples could not be evaluated. Conclusion: The most common mycobacterial isolates were M. intracellulare, M. abscessus and M. simiae. According to this study, PCR-RFLP method is a useful method that provides faster and more precise diagnosis in comparison to conventional methods in the identification of mycobacteria at the species level. However, the steps of evaluating DNA fragments formed after enzyme cutting and comparing them with reference algorithms were found to be critical. It was concluded that standardization, especially in imaging processes, is very important in determining the correct type.

Background: Rapid and accurate identification of mycobacteria is important for the treatment of the disease. Conventional methods used in identification have long been replaced by molecular methods with their controversial results and limitations in identifying over 170 species. In this study, it was aimed to identify 34 NTM isolates and 14 reference strains isolated from respiratory tract samples (sputum) sent from Adıyaman University Training and Research Hospital and from Atatürk Thoracic Diseases and Thoracic Surgery Training and Research Hospital (Doc. İsmail Ceyhan) according to the voluntary procedure at specify level by PCR-RFLP method. Material and methods: In our study, Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Lenght Polymorphism (PCR-RFLP) method was used. It was ensured that the isolates coming to our laboratory were cultivated on LJ media. DNA isolation was performed by boiling the samples from the cultivated cultures and then amplified by PCR using primers specific to the hsp65 gene region. After amplification, PCR products were kept overnight with BstEII and HaEIII enzymes, and DNA fragments were evaluated by comparison with reference algorithms. Results: Species distribution of NTMs out of 34 isolates used in our study; 23.52% (8/34) M. intracellulare, 17.64% (6/34) M. gordonae, 17.64% (6/34) M. abscessus, 17.64% (6/34) M. simiae was determined as 5.88% (2/34) M. lentiflavum, 2.94% (1/34) M. kansasii and 2.94% (1/34) M. scrofulaceum. 4 of the samples could not be evaluated. Conclusion: The most common mycobacterial isolates were M. intracellulare, M. abscessus and M. simiae. According to this study, PCR-RFLP method is a useful method that provides faster and more precise diagnosis in comparison to conventional methods in the identification of mycobacteria at the species level. However, the steps of evaluating DNA fragments formed after enzyme cutting and comparing them with reference algorithms were found to be critical. It was concluded that standardization, especially in imaging processes, is very important in determining the correct type.